PENGENALAN AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS

ABSTRACT

Gel electrophoresis is a method of separating molecules such as DNA and RNA by charge, size, and shape. When an electric voltage is applied to the gel, negatively charged molecules move toward the positive electrode, and positively charged molecules move toward the negative electrode. An integral part of this procedure requires either the sedimentation of the plasmid DNA through an alkaline or neutral sucrose gradient or equilibrium density centrifugation with an intercalating dye such as ethidium bromide. The aim of this study is make understanding of student about the electrophoresis’s methode in purpose to detect DNA’s expression. This study carried out in two part, those are making agarose gel and electrophoresis itself. After this study we can learn that agarose is insoluble in water (or buffer) at room temperature but it dissolves in boiling water. We also see the DNA-bands as the result of electrophoresis.

Keyword : DNA, agarose gel, elektroforesis, ethidium bromide

PENDAHULUAN

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Bagian terbesar dari ADN terdapat di dalam nukleus terutama dalam kromosom (Suryo, 1998). Molekul ADN juga ditemukan di dalam mitokondria, plastida dan sentriol serta dalam kloroplast dari ganggang dan tumbuhan tingkat tinggi (Suryo, 1997).

Asam nukleat menurut Suryo (1997) tersusun atas nukleotida yang terdiri dari:

1.  Gula: molekul gula yang menyusun DNA adalah sebuah pentosa yaitu deoksiribosa

2.  Pospat: Molekul pospatnya berupa PO4

3.  Basa: basa nitrogen yang menyusun molekul DNA dibedakan menjadi kelompok pirimidin ( Sitosin dan Timin ) dan kelompok purin ( Adenin dan Guanin)

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarose. Agarosa merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit mengandung sulfat. Agarosa dikenal sebagai fraksi pembentuk gel dari agar-agar, dimana sifat-sifat gel yang dihasilkannya mendekati sifat-sifat gel ideal untuk keperluan bidang bioteknologi. Elektroforesis gel agarose adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Elektroforesis gel agarose dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi dan mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis dan pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat sensitif dan tidak memerlukan radioisotop atau ultrasentrifugasi (Meyers et al,1976; Sambrook et al, 1989; Subaryono et al, 2003).

Selanjutnya, untuk mendeteksi lokasi DNA serta potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit DNA dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator (Sambrook et al, 1989).

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu memahami metode elektroforesis dalam mendeteksi ekspresi DNA.

BAHAN DAN CARA

Praktikum ini dilaksanakan dalam 2 tahap yaitu pembuatan gel agarose dan elektroforesis. Peralatan yang diperlukan untuk tahap pembuatan gel agarose adalah agarose (Gibco BRL), aquades, labu erlen meyer 200ml, microwave dan cetakan gel. Pembuatan gel agarose diawali dengan membersihkan cetakan dan sisir gel menggunakan alkohol 70% dan memasangkan sisir gel pada cetakan dengan posisi yang stabil. Larutan gel dibuat dari 0,5gr agarose yang dimasukkan ke dalam labu erlen meyer yang berisi 25ml aquades. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam microwave dan dipanaskan sampai mendidih (kurang lebih 5 menit). Setelah mendidih, larutan dikeluarkan dan digoyangkan agar lebih homogen. Setelah agak dingin larutan dimasukkan pelan-pelan ke dalam cetakan agar tidak terjadi gelembung udara.

Tahap elektroforesis memerlukan alat dan bahan seperti sampel DNA, gel agarose 0.9%, buffer TBE (10mM Tris HCl pH 8.0, 1mM ETDA), gel loading buffer (0.25% bromphenol blue, 0.25 5 xylene cyanol FF, 40% sukrosa dalam air)  dan aparatus elektroforesis horisontal. TBE dan gel agarose disiapkan dalam aparatus elektroforesis dan kemudian disambungkan dengan sumber listrik 220 volt. Larutan gel loading buffer sebanyak 2μl diletakkan di atas parafilm dengan menggunakan mikropipet dan ditambahkan sampel DNA 8μl. Campuran tersebut diaspirasi sebanyak 3-4x agar homogen kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel agarose yang telah terendam buffer TBE tadi. Untuk pembanding dimasukkan pula DNA ladder dan aquades ke dalam sumuran. Gel agarose tersebut diangkat dan dimasukkan dalam suatu tempat dari bahan plastik yang berisi TE buffer dan 0,5 μl/mL ethidium bromide kemudian diguncang dalam shaker selama 10 menit. Ekspresi DNA pada gel tersebut kemudian diamati dengan UV light.

HASIL PENGAMATAN

Gambar 1. Gel Agarose Gambar 2. Hasil pengamatan di bawah sinar UV

PEMBAHASAN

Agarose murni berbentuk bubuk dan tidak larut dalam air (maupun buffer) pada suhu kamar namun larut pada air mendidih. Biasanya dipergunakan mikrowave untuk melarutkan agarose dalam air, seperti yang dilakukan pada praktikum kali ini. Agarose yang dipanaskan akan meleleh. Ketika mulai dingin, agarose mengalami apa yang dikenal sebagai polimerisasi. Alih-alih tetap menjadi larutan, polimer gula berikatan silang satu sama lain dan menyebabkan perubahan dari larutan gel menjadi matriks semisolid seperti jelly namun lebih padat. Semakin banyak agarose yang dilarutkan dalam air mendidih, semakin padat gel yang akan terbentuk. Larutan tersebut harus ditunggu sampai cukup hangat sebelum dimasukkan pada casting tray karena jika terlalu panas akan mengakibatkan kerusakan permanen pada casting tray (Anonim,-).

Elektroforesis sebenarnya adalah proses penyaringan. Semakin besar fragmen DNA semakin mudah terjerat dalam matriks dan migrasinya lebih lambat. Fragmen yang kecil akan bergerak lebih cepat pada laju proporsional sesuai dengan ukurannya.

Dari hasil praktikum dapat dilihat pita DNA yang menunjukkan adanya pergerakan DNA karena saat arus listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif (Meyers et al,1976).  Fosfat DNA bermuatan negatif, maka dari itu ia bergerak menuju ke muatan positif. Yang perlu diperhatikan adalah pemberian arus listrik pada gel agarose tidak boleh sembarangan karena jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA (Anonim,-).

KESIMPULAN

  1. Agarose tidak dapat larut dalam air/bufer pada suhu kamar maka dari itu diperlukan pemanasan dengan mikrowave
  2. Terlihat pita DNA pada gel agarose setelah elektroforesis karena perpindahan molekul DNA yang bermuatan negatif menuju ke elektroda bermuatan positif.

5 responses

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s